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Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 9678 (2022) Citar este artículo

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En un huésped humano, los patógenos bacterianos Staphylococcus aureus y hongos Candida albicans forman una biopelícula mixta que causa mortalidad y morbilidad graves. Sin embargo, faltan investigaciones sobre la formación y erradicación de biopelículas mixtas en condiciones dinámicas. Por lo tanto, este estudio empleó una técnica de microfluidos para analizar la formación en tiempo real de biopelículas de especies mono y duales (S. aureus y C. albicans) y el tratamiento óptico no invasivo de la biopelícula madura establecida utilizando luz láser de 405 nm. Un mezclador en forma de espina de pescado mezcló completamente células bacterianas y fúngicas en el medio de crecimiento antes de inyectarlas en los canales de observación del chip de microfluidos. A un caudal de 1,0 µL/min de medio de crecimiento durante 24 h, la cobertura de la biopelícula bacteriana fue hasta un 15 % mayor que la de la biopelícula fúngica (50 % para bacterias frente a 35 % para hongos). Por otro lado, la biopelícula de especies duales produjo la mayor cobertura de ~ 96,5% debido a la interacción colectiva entre S. aureus y C. albicans. El número de eventos de proliferación celular en S. aureus fue mayor que el de C. albicans durante 12 h, lo que indica que la biopelícula de S. aureus se desarrolló más rápido que la de C. albicans. La nueva plataforma de prueba in situ mostró un efecto bactericida significativo (80%) de la luz láser de 405 nm a 1080 J/cm2 hacia la biopelícula de S. aureus establecida, mientras que el mismo tratamiento eliminó aproximadamente el 69% de las células mixtas en la doble -biopelícula de especies. Este estudio reveló que la plataforma de microfluidos desarrollada podría utilizarse para monitorear la formación de biopelículas de especies duales en tiempo real y los efectos antimicrobianos inducidos por láser en biopelículas de especies duales.

Los microorganismos existen en comunidades complejas, incluidos entornos hospedadores, clínicos e industriales1,2. La presencia de comunidades microbianas complejas es beneficiosa para una o ambas especies microbianas en el medio ambiente3. Además, las interacciones polimicrobianas tienen numerosas ventajas, incluidos cambios en las respuestas inmunes del huésped, patogénesis microbiana y virulencia4. Las interacciones polimicrobianas en numerosos entornos naturales, incluido el huésped, dan como resultado la formación de biopelículas, que contienen microcolonias heterogéneas de células microbianas rodeadas de sustancias poliméricas extracelulares de producción propia5. Las poblaciones microbianas en la biopelícula se benefician en gran medida entre sí en términos de intercambio de nutrientes, metabolitos, moléculas de señalización, materiales genéticos, resistencia al tratamiento antimicrobiano y protección contra las respuestas inmunológicas del huésped6,7,8.

Las infecciones causadas por biopelículas polimicrobianas dieron como resultado una tasa de mortalidad más alta (70%) que la causada por biopelículas monoespecies9. La mayor parte de la información sobre el proceso de formación de biopelículas y las características de virulencia se ha recopilado de una única especie bacteriana9. La mayoría de las pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos se basan enteramente en cultivos de células planctónicas de una sola especie, lo que aumenta las posibilidades de fracaso en el tratamiento de las infecciones polimicrobianas10,11. En el contexto contemporáneo, la investigación sobre biopelículas polimicrobianas que emplean comunidades microbianas de múltiples especies es de considerable interés para determinar el verdadero impacto de la biopelícula polimicrobiana en los entornos naturales, clínicos e industriales4. Los investigadores se centran en la interacción entre hongos y bacterias para comprender las interacciones polimicrobianas a nivel entre reinos12,13. Los hongos patógenos, en particular Candida albicans, con frecuencia se han aislado conjuntamente con numerosas especies de bacterias patógenas de la cavidad bucal, la piel y la superficie mucosa, el tracto gastrointestinal, los pulmones y la superficie vulvovaginal14,15. Staphylococcus aureus y C. albicans se han identificado juntos en diversas enfermedades asociadas a biopelículas, incluidas la fibrosis quística, la queratitis, la neumonía asociada a ventiladores, la estomatitis de prótesis dentales, la periodontitis, las infecciones del tracto urinario y las infecciones por quemaduras, según lo revisado por Carolus et al.14. S. aureus produce varios factores de virulencia, incluidas proteasas, hemolisina, leucocidinas, enterotoxina, moléculas inmunomoduladoras y toxina exfoliante16. De manera similar, la patogenicidad de C. albicans exhibió diversos factores de virulencia, como cambios morfológicos, desarrollo de biopelículas, producción de adhesinas, liberación de enzimas hidrolíticas y penetración de la superficie de la célula huésped4,17.

Varias investigaciones han demostrado que la interacción entre S. aureus y C. albicans implicó interacciones tanto físicas como químicas14,18. La proteína receptora específica de hifas (Als3p) participa en la interacción física entre S. aureus y C. albicans, mientras que las moléculas de señalización de detección de quórum (QS) participan en la interacción química15. Estas interacciones conducen a una mayor formación de biopelículas y al desarrollo de mecanismos de resistencia contra agentes antimicrobianos19. Además, la coinfección de S. aureus y C. albicans con el organismo modelo animal resultó en un aumento de la carga microbiana en los órganos del huésped, así como en una tasa de mortalidad significativa20,21. En las infecciones polimicrobianas, S. aureus y C. albicans comparten un nicho común en el cuerpo humano, como la piel, la vagina, las fosas nasales, la faringe, la cavidad abdominal y la mucosa oral22. Las interacciones físicas se establecen cuando S. aureus se adhiere a la superficie celular de C. albicans, mientras que la interacción química está mediada por la participación de moléculas de señalización QS, sustancias químicas secretoras generadas por S. aureus y C. albicans o por el huésped humano14,23. . A pesar del éxito de la investigación in vitro para dilucidar la interacción física entre S. aureus y C. albicans, los estudios in vivo son necesarios para comprender el mecanismo de interacción en diversos tejidos y órganos del huésped, que son la causa principal de la letalidad sinérgica. Además, el flujo de secreciones y fluidos corporales expone a patógenos microbianos, incluidos S. aureus y C. albicans, en numerosas áreas del cuerpo de los huéspedes humanos y animales, como la boca, los pulmones, el intestino, el estómago y el sistema urinario24. La mayoría de las interacciones polimicrobianas in vitro y la formación de biopelículas de especies duales entre S. aureus y C. albicans se han investigado en condiciones estáticas. Sin embargo, faltan investigaciones sobre la formación de biopelículas polimicrobianas en condiciones dinámicas.

Recientemente, los microfluidos integrados se identificaron como un enfoque prometedor para estudiar las interacciones microbianas25. También se han investigado varios otros fenómenos importantes, incluidas las influencias de factores físicos y químicos sobre la viabilidad, proliferación, funcionalidad y motilidad celular10,26. Además, el sistema de microfluidos puede ayudar a comprender los efectos de los factores hidrodinámicos, como el caudal y las fuerzas de corte, en la etapa inicial del desarrollo de biopelículas y la morfología celular26. Crabbé et al. Estuvieron de acuerdo en que las fuerzas de corte afectan la adherencia microbiana, la persistencia y, por lo tanto, la capacidad de infección de los patógenos oportunistas27. Teniendo esto en cuenta, varios informes han demostrado el uso de microfluidos para estudiar la formación de biopelículas a nivel de una sola especie, para probar la influencia de las condiciones hidrodinámicas, la quimiotaxis bacteriana y la detección de antibióticos o fármacos antibiopelículas26,28. De manera similar, otros estudios investigaron el monitoreo en tiempo real de la formación de biopelículas a nivel de especie única29,30,31,32. Además, el sistema de microfluidos se ha utilizado para estudiar las interacciones huésped-patógeno33. Aunque la formación de biopelículas de múltiples especies se ha realizado utilizando un dispositivo de microfluidos34, como en la placa dental, relativamente pocos estudios han investigado el monitoreo en tiempo real de la producción de biopelículas a nivel de múltiples especies35,36. La implementación del método de microfluidos puede ayudar a monitorear la formación de biopelículas de especies mono y duales entre S. aureus y C. albicans en tiempo real. Además, se ha utilizado ampliamente un tratamiento óptico para las biopelículas bacterianas utilizando luz láser de 405 nm para evaluar el efecto antibacteriano sobre las biopelículas bacterianas in vitro37; sin embargo, faltan investigaciones sobre la luz láser de 405 nm para la erradicación de biopelículas de especies duales con la ayuda de la plataforma de microfluidos en condiciones hidrodinámicas. Por lo tanto, el estudio actual pretendía desarrollar una plataforma de microfluidos versátil pero simple para investigar la formación de biopelículas de especies mono y duales de S. aureus y C. albicans en tiempo real. Además, se utilizó un enfoque físico, la fotoirradiación con luz láser de 405 nm, para erradicar las biopelículas maduras desarrolladas de especies mono y duales de S. aureus y C. albicans en circunstancias hidrodinámicas.

La Figura 1 muestra imágenes del chip diseñado, así como la correlación entre el efecto de mezcla de colores y la formación de biopelícula generada por el mezclador en espina de pescado. El canal de microfluidos se diseñó para tener 100 µm de ancho y 180 µm de alto (Fig. 1a). Como resultado, el chip permitió a los investigadores investigar la adhesión, proliferación y difusión a nivel unicelular durante el desarrollo de biopelículas. El efecto de mezcla de los dos colores (amarillo y azul) antes y después del mezclador en espiga se muestra en la Fig. 1b. Antes de la mezcla eran visibles zonas de dos colores (arriba), mientras que el color verde resultó de una buena mezcla (abajo). Este efecto se muestra en la Fig. 1c. En el caso de la implementación sin mezcla, el valor de gris y el ancho del canal cambiaron significativamente. Por el contrario, el valor de gris se volvió casi constante en toda la anchura investigada del canal observado. Como resultado, durante la fase de inyección, la capacidad de mezcla del chip propuesto con dos microorganismos se distinguió claramente en los canales de entrada y observados. Se identificaron dos áreas aparentes de bacterias y hongos en el canal de entrada. En particular, se observó un cultivo mixto después de mezclar en espina de pescado (Fig. 1d).

Visualización de canales de microfluidos y capacidad de mezcla: (a) descripción general del chip de microfluidos propuesto (arriba) e imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de los canales en espina de pescado (abajo a la izquierda) y observados (abajo a la derecha) (canal de entrada de IC, canal de espina de pescado de HC , canal observado OC; barra de escala en (a) = 100 µm), (b) efecto de mezcla de colores antes (arriba) y después (abajo) del mezclador en espiga (barra de escala en (b) = 100 µm), (c) gris valor medido a partir de líneas azules en imágenes de mezcla de colores (b) antes y después del mezclador en espiga, y (d) mezclas de bacterias y hongos antes y después del mezclador en espiga en la fase de inyección (barra de escala en (d) = 10 µm). La línea superior representa canales de entrada con dos áreas de color aparente (azul y amarillo), que luego se mezclaron completamente en un área de color verde en el canal observado.

La Figura 2a muestra una simulación óptica de un rayo láser que se propaga a través de un sistema óptico. El haz de salida divergente (distribución gaussiana y apertura numérica = 0,22) del sistema láser se colimó uniformemente y se entregó a tres canales con puntos de haz iguales de 5 mm (Fig. 2b; izquierda y centro). Los tres niveles de potencia en estos canales eran 50, 25 y 12,5% de la potencia de salida del sistema láser, respectivamente. Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 2c para validar la simulación. Las emisiones de luz de los tres haces planos en la superficie del chip indicaron que el haz gaussiano de la fuente láser se difundió en puntos uniformes en la superficie del canal. Las intensidades fueron 50, 100 y 150 para cada unidad, respectivamente (Fig. 2d).

Configuración del sistema óptico para el tratamiento de biopelículas: (a) configuración del modelo óptico para simulación, (b) puntos de rayo simulados emitidos desde la salida del láser (izquierda) y en tres canales observados (derecha), (c) puntos de rayo láser medidos en los tres canales observados canales en el chip de microfluidos propuesto, y (d) intensidad de la luz cuantificada a partir de los tres puntos del rayo láser en los tres canales observados (fuente láser LS, detectores ópticos D1 y D2, lentes L1 y L2, difusor óptico OD, BS1, BS2 y Los divisores de haz BS3, el medidor de potencia PM, CN1, CN2 y CN3 observaron los canales del 1 al 3 en el chip de microfluidos; barra de escala = 3 mm).

La Figura 3 compara las coberturas de biopelículas de la formación de biopelículas monoespecies en canales de microfluidos a diversos caudales con la biopelícula cultivada en condiciones estáticas en placas de microtitulación. Durante el experimento, la frecuencia de adhesión de las células de S. aureus fue mayor que la de las células de C. albicans. Los microorganismos no sólo se adhirieron al suelo de los canales, sino también entre sí, formando agregados muy grandes. Además, se observó la formación de serpentinas después de la inyección del inóculo en los canales de microfluidos. La serpentina limpiaba periódicamente los microorganismos recién adheridos a la superficie del vidrio. Como resultado, en este estudio, integramos un mezclador en espiga en el canal de microfluidos. El flujo de microorganismos inyectados se mezcló completamente antes de pasar por los canales observados. Además, el canal se construyó en forma cónica en las entradas para analizar la formación de biopelículas a diferentes caudales en un canal (Fig. 1b). La densidad microbiana disminuyó a medida que aumentó la distancia desde las entradas debido al aumento en la velocidad del flujo. Se bombearon tres canales a tres caudales distintos durante un cierto período de tiempo. En el momento de la adhesión y proliferación, ambos microorganismos pueden experimentar altos caudales (caudal = 1,5 l/min; velocidad del flujo = 25 mm/min). Como la velocidad de corte fue de 50 s-1 y el número de Reynolds fue de 5,1 (Re <100), el flujo del medio se consideró laminar.

Comparación de las coberturas de biopelículas de la formación de biopelículas monoespecie bajo varios caudales (0,5, 1,0 y 1,5 µL/min) en canales de microfluidos con condiciones estáticas cultivadas en placas de pocillos después de 24 h de cultivo. ( a, c ) Biopelícula de S. aureus en condiciones hidrodinámicas. ( b, d ) Biopelícula de C. albicans en condiciones hidrodinámicas. ( e, f ) Biopelículas de una sola especie (S. aureus vs. C. albicans) en condiciones estáticas (flechas azules = matriz extracelular; flechas rojas = grupos de pseudohifas; flechas amarillas = formación de gemaciones). Las líneas cian representan la cobertura de biopelícula predeterminada (~ 50%) en el campo de visión de los microcanales. Los gráficos de barras azules y rojas en (e, f) muestran crecimientos de biopelículas de S. aureus y C. albicans in vitro en placas de 96 pocillos, respectivamente, medidos por la densidad óptica a 570 nm.

Después de 12 h de cultivo de 1,5 µL/mm, S. aureus cubrió solo el 7% del campo de visión (FOV), mientras que C. albicans se adhirió y expandió progresivamente hasta cubrir el 16% del FOV. Por otro lado, las bacterias S. aureus se habilitaron después de 12 h de unión y maduraron rápidamente hasta convertirse en una biopelícula significativa después de 24 h (cobertura de biopelícula del 28,7%). Como se muestra en la Fig. 3c, d (abajo), tanto S. aureus como C. albicans apenas produjeron biopelículas densas. Sin embargo, a 0,5 µL/mm, el casi no adherente S. aureus solo vibraba sobre sí mismo a lo largo de las paredes laterales y las bacterias planctónicas fluían lentamente a través de los canales de microfluidos. Como resultado del flujo de S. aureus planctónico no adherente, rara vez se detectó movimiento unicelular. Sin embargo, después de 24 h de cultivo, observamos una biopelícula demasiado grande que contenía bacterias planctónicas (80,2% del FOV). De manera similar, la biopelícula de C. albicans se desarrolló modestamente durante 16 h antes de proliferar rápidamente durante 8 h adicionales (62,5% del FOV; Fig. 3d; arriba). Luego se usó 1,0 µl/min para hacer crecer biopelículas de S. aureus y C. albicans, cubriendo la biopelícula microbiana aproximadamente el 50 % del FOV. Sólo los microorganismos adheridos fueron visibles bajo esta condición hidrodinámica, mientras que los microorganismos no adherentes fueron eliminados por el movimiento del medio.

S. aureus y C. albicans produjeron biopelículas con coberturas del 49,5% y 35,1%, respectivamente. La Figura 3c,d muestra las observaciones cualitativas (centro). La matriz extracelular (ECM) de las biopelículas de S. aureus varió, mientras que las biopelículas de C. albicans tenían la apariencia de levadura, desarrollo de gemaciones y pseudohifas aparentes. En condiciones estáticas, los tipos morfológicos de las dos biopelículas microbianas fueron equivalentes al bajo caudal de las condiciones dinámicas (0,5 µL/min). La biopelícula de S. aureus tenía una arquitectura de biopelícula más extendida, mientras que la biopelícula de C. albicans tenía agregados locales muy grandes (Fig. 3e, f). En buena concordancia con las imágenes SEM, las densidades ópticas medidas de las biopelículas de S. aureus y C. albicans cultivadas en placas de 96 pocillos fueron 1,0 y 0,7, respectivamente.

La Figura 4 muestra una investigación de seguimiento unicelular del desarrollo temprano de biopelículas utilizando imágenes de microscopía de lapso de tiempo de S. aureus y C. albicans. Un evento de proliferación se definió como la creación de nuevos microbios, mientras que un evento de liberación se definió como la separación de un microbio de sus células madre o el escape de su ubicación anterior. Pudimos analizar el desarrollo de biopelículas de varios microorganismos en condiciones hidrodinámicas y ambientales similares en un experimento diseñando tres canales separados en un chip. C. albicans colonizó muy rápidamente la superficie del suelo (Fig. 4a; izquierda). Después de 12 h de incubación, se observó una biopelícula madura de C. albicans. Por otro lado, S. aureus se adhirió, multiplicó y extendió por el entorno. Además, el número de células de S. aureus adheridas al suelo de vidrio era mayor que el de células de C. albicans. Después de 4 h de cultivo, observamos un crecimiento progresivo y ausencia de secreción de células de C. albicans (Fig. 4b; abajo). Después de 30 min de adherencia se observó un nuevo desarrollo de gemación. Después de ese tiempo, las células de C. albicans comenzaron a liberarse modestamente. Sin embargo, el número de eventos de multiplicación observados en la incubación de C. albicans fue mayor que el número de casos de liberación. Como consecuencia, después de 12 h de incubación, la biopelícula creció gradualmente y maduró. A pesar del gran número de eventos de liberación, S. aureus exhibió una rápida adhesión después de 2 h de incubación (Fig. 4b; arriba). Las bacterias S. aureus se estaban dividiendo activamente al comienzo de la incubación. En el suelo había más células de S. aureus que de C. albicans. A pesar de este comportamiento, S. aureus continuó liberándose y proliferando entre 3 y 6 h, lo que explica el retraso en la colonización bacteriana por S. aureus. Después de 6 h de cultivo, las células de S. aureus se multiplicaron significativamente y produjeron una biopelícula fuerte después de 12 h de inyección del cultivo. Estos eventos no se observaron en las células de C. albicans. La Figura 4c muestra la reproducción de células de C. albicans. Inicialmente se formó un patrón de gemación después de aproximadamente 30 minutos de inyección, y el núcleo madre dentro del hongo se dividió en dos partes. El núcleo hijo luego pasó al patrón de gemación. Finalmente, la levadura hija se separó de la madre e indujo una cicatriz en ciernes en la superficie celular.

Análisis de seguimiento unicelular de la formación temprana de biopelículas: (a) imágenes de microscopía de lapso de tiempo (izquierda = S. aureus; derecha = C. albicans), (b) número de eventos durante 12 h de cultivo (arriba = visualización de la liberación y eventos de proliferación (medio = número de eventos/FOV del crecimiento de S. aureus; abajo = número de eventos/FOV del crecimiento de C. albicans) y (c) formación de gemaciones de células de C. albicans a los 0, 30 y 60 min. (barra de escala = 20 µm). La flecha amarilla indica el núcleo dentro de las células de C. albicans.

La Figura 5 ilustra la morfología espacial y las interacciones físicas de la formación de biopelículas de especies duales por S. aureus y C. albicans. La imagen de campo brillante en la Fig. 5a muestra que S. aureus desarrolló colonias no solo en la superficie del piso sino también en las superficies de las células de C. albicans. En condiciones hidrodinámicas, las bacterias S. aureus se vieron afectadas por el flujo de fluido y las bacterias no adherentes fueron expulsadas hacia las salidas. Sin embargo, la superficie de las células de C. albicans (formas de levadura y pseudohifas) actúa como un andamio, promoviendo la adherencia de las células de S. aureus. La Figura 5a también muestra varias formas de patógenos de C. albicans, como levadura, forma de gemación y grupos de pseudohifas, que dan como resultado una mayor resistencia a los germicidas antifúngicos. En general, las biopelículas duales mostraron un comportamiento evolutivo en el tiempo en términos de número de células, actividad metabólica y biomasa total. La imagen fluorescente en la Fig. 5b confirma la arquitectura de la biopelícula dual. Dos células interactuaron entre sí para formar una biopelícula condensada. S. aureus siguió la formación de C. albicans; por lo tanto, se observó una biopelícula muy pequeña de S. aureus lejos de las ubicaciones de C. albicans. La Figura 5c muestra la tendencia del crecimiento de biopelículas duales durante 24 h de incubación. Dentro de las 4 h posteriores a la incubación inicial, el número de liberaciones y proliferación en los dos patógenos fue idéntico. Por tanto, la cobertura de biopelícula fue aproximadamente el 20% del FOV. La biopelícula de doble especie se desarrolló significativamente entre las 6 y las 12 h. Sin embargo, 12 h después, la formación de biopelícula mixta parece haberse desarrollado lentamente hasta cubrir el 96,5% del FOV después de 24 h de incubación debido a la fase estacionaria. Cuando el objetivo del microscopio invertido se movía hacia arriba y hacia abajo, se veía claramente una biopelícula más gruesa en la dirección perpendicular a la superficie del suelo. Para comparar con las condiciones estáticas, la biopelícula de doble especie también se incubó en placas de microtitulación de 96 pocillos. Por el contrario, los dos microorganismos se adhirieron y proliferaron uniformemente sobre la superficie incubada (Fig. 5d). En particular, los patógenos de C. albicans crecieron en diferentes fases, incluidas la levadura, la formación de gemaciones y las pseudohifas.

Cobertura de biopelícula de la formación de biopelículas de especies duales (S. aureus + C. albicans): (a) imagen de campo brillante, (b) imagen fluorescente con tinte SYTO-9, (c) desarrollo temporal de la cobertura de biopelícula bajo un caudal de 1 μL/min, y (d) imagen SEM en condiciones estáticas (barra de escala = 20 μm).

La Figura 6 muestra la dosis óptima de láser para una erradicación exitosa de biopelículas. La biopelícula separada en cada canal fue irradiada por la energía óptica predeterminada debido al avance del empleo de tres canales en un chip y la integración del suministro del sistema óptico con tres vías ópticas (50%, 25% y 12,5% de la salida del láser). fuerza). Después de 90 minutos de irradiación con luz láser, las vitalidades de las biopelículas de S. aureus fueron del 71,1%, 46,5% y 19,8%, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (Fig. 6c; p <0,01).

Tratamiento con láser de la biopelícula monoespecie de S. aureus y C. albicans durante 90 minutos a diversas irradiancias: (a) control sin tratar (arriba) y muestras tratadas (abajo) de la biopelícula de S. aureus, (b) control sin tratar ( arriba) y muestras tratadas (abajo) de biopelícula de C. albicans cultivada en el canal 1, y (c) comparación de las intensidades de fluorescencia medidas (fluencias en los canales 1, 2 y 3 = 1080, 540 y 270 J/cm2, respectivamente; barra de escala = 20 μm, muestras de control no tratadas con C-Sa de biopelícula de S. aureus, muestras de S. aureus tratadas con 1-Sa, 2-Sa, 3-Sa en los canales 1, 2 y 3, respectivamente, C-Ca sin tratar muestras de control de biopelícula de C. albicans, muestras de C. albicans tratadas con 1-Ca, 2-Ca, 3-Ca en los canales 1, 2 y 3, respectivamente, ***p < 0,01 frente a control sin tratar, N = 5 ).

Por otro lado, las biopelículas de C. albicans fueron más resistentes a la luz láser, con viabilidades celulares del 86,2%, 69,7% y 26,4%, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (Fig. 6c; p <0,01). Luego se eligió la irradiancia máxima de luz láser para dos tratamientos de biopelícula separados para compararla con la efectividad de limpieza de la biopelícula de doble especie. La Figura 7 muestra la eficacia de la terapia con láser de las biopelículas de especies duales de S. aureus y C. albicans a un caudal de 1 µL/min. La muestra de control no tratada era completamente verde, lo que sugiere que todas las células estaban vivas. Por otro lado, la intensidad del verde disminuyó constantemente con el tiempo (Fig. 7a-d). Se determinó que la viabilidad celular era del 31,5% después de 90 minutos de exposición a la luz láser, en comparación con los controles no tratados (Fig. 7e; p <0,01).

Tratamiento con láser de la biopelícula de especie dual (S. aureus + C. albicans) con un caudal de 1 µL/min: (a – d) imágenes de lapso de tiempo de las muestras después de los tratamientos de 0, 30, 60 y 90 min, respectivamente, y (e) intensidades verdes medidas a partir del control no tratado (0 min) y las muestras tratadas (CTRL: control no tratado; barra de escala = 20 μm; ***p <0,01 frente a control no tratado; N = 5).

Este estudio es importante debido al seguimiento en tiempo real de la formación de biopelículas de especies mono y duales de S. aureus y C. albicans a nivel unicelular, seguido del desarrollo de un enfoque de terapia antimicrobiana. La adherencia bacteriana fue controlada espacialmente y homogénea en el piso del microcanal. En este estudio, diseñamos y desarrollamos un sistema de microfluidos para estudios en tiempo real sobre la adherencia de especies bacterianas/fúngicas en superficies y la formación de biopelículas en un microcanal en condiciones bien controladas. Teheranirokh et al. informaron que el tamaño del microcanal descrito anteriormente proporcionó un control preciso de los entornos hidrodinámicos para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM38. Además, la investigación actual implicó el cultivo, lo que permitió establecer biopelículas de células fúngicas y bacterianas, ya sea individualmente o en forma mixta utilizando sus respectivos medios de crecimiento o medios de cultivo igualmente mezclados. Por tanto, el cultivo celular de las dos especies microbianas debe mezclarse completamente antes de inocularlo en los canales observados en el chip de microfluidos. Se emplearon flujos transversales en este enfoque de mezcla pasiva en espiga para producir microvórtices dentro de canales de microfluidos38. El propósito de utilizar esta innovadora técnica de mezcla fue controlar las concentraciones del cultivo celular individual en la fase de mezcla inicial e investigar todo el proceso de interacción durante la formación de biopelículas entre reinos. Como resultado, todos los microorganismos y medios de crecimiento se mezclaron completamente durante el establecimiento de biopelículas de una y dos especies. Además, se analizaron simultáneamente en un chip tres arquitecturas fenotípicas distintas de biopelículas bacterianas, fúngicas y mixtas debido a los tres diseños de canales independientes del dispositivo de microfluidos. Como resultado, el experimento se puede completar tres veces más rápido que con un solo canal en un chip. La configuración propuesta se originó a partir del largo tiempo de cultivo de biopelículas convencional (tiempo de cultivo > 24 h)39.

Utilizando un dispositivo de microfluidos bien establecido, los hallazgos actuales mostraron que más células fúngicas adherentes en la fase de inyección no dieron como resultado una mayor colonización de la superficie ni desarrollo de biopelículas en comparación con la biopelícula bacteriana. Esto se atribuyó a una mayor propensión de las bacterias a crecer en un corto período de incubación. En esta investigación, los microbios permanecieron adheridos a la superficie del canal durante 2 h, lo que concordó con estudios previos40. Wang y cols. Confirmó que las bacterias se adhirieron pero no proliferaron, ya que se descubrieron bacterias únicas de E. coli en las superficies durante las primeras 2 h. Este fenómeno se conoce como fase de retraso de la curva de crecimiento bacteriano40. La adhesión bacteriana y el desarrollo de biopelículas se ven afectados por las condiciones experimentales (por ejemplo, los medios de crecimiento y las características de la superficie del material) y los tipos de especies bacterianas41,42.

Sin embargo, en este estudio, a un caudal de 0,5 µL/mm en el canal, las células de S. aureus casi no adherentes (planctónicas) vibraron a lo largo de las paredes laterales y fluyeron lentamente a través de los canales de microfluidos. Debido al movimiento aleatorio de las células bacterianas planctónicas, resulta complicado registrar imágenes, lo que finalmente dio lugar a una estimación errónea de la cobertura de la biopelícula simple. Los estudios in vitro en condiciones estáticas también se vieron afectados por las células planctónicas, que afectan la cuantificación y el procesamiento posterior de la biopelícula43. Así, con la ayuda del dispositivo de microfluidos recientemente desarrollado, las condiciones hidrodinámicas se controlaron bien para la investigación unicelular. Como resultado, la tecnología de microfluidos desarrollada en este estudio permitió el seguimiento automatizado de células individuales y el impacto de las condiciones hidrodinámicas durante el crecimiento y la formación de biopelículas en los canales finos. El dispositivo de microfluidos también se integró con irradiación láser, lo que ayudó en el tratamiento en tiempo real de células microbianas a diferentes velocidades de flujo. Las células bacterianas de S. aureus proliferaron y se difundieron más rápido que las células de C. albicans, lo que resultó en una arquitectura de biopelícula madura de S. aureus más extendida. La formación de gemaciones en las células de C. albicans aparentemente se observó con la migración del núcleo de las células "madres" a las células "hijas". Después de aproximadamente 30 minutos de inyección, surgió un patrón de gemación y el núcleo madre dentro de las células fúngicas se dividió en dos partes. Luego, los núcleos hijos se transfirieron a las yemas. Finalmente, la levadura hija se separa de la madre y forma una cicatriz en ciernes en la superficie celular44. Además, la bacteria S. aureus se adhirió al suelo del canal y a la superficie de las células del hongo C. albicans para formar una biopelícula entre reinos. Los informes mostraron que la superficie de las células de C. albicans (formas de levadura y pseudohifas) actuaba como un andamio para promover la adherencia de S. aureus a las células de C. albicans en el proceso de formación de biopelículas entre reinos18,45. Así, observamos un desarrollo colectivo de la biopelícula mixta con una cobertura FOV del 96,5% durante 24 h de inoculación bajo un caudal de 1 µL/min, que fue casi dos veces más rápido en comparación con la biopelícula de S. aureus y tres veces más rápido en comparación con a la formación de biopelículas de C. albicans.

Según el modelo propuesto, una plataforma de microfluidos es apropiada para el análisis del efecto de los factores de crecimiento, como el estrés cortante, sobre los fenómenos anteriores en varias especies microbianas y la estabilidad y adaptabilidad de la plataforma para probar nuevos agentes antimicrobianos. Por ejemplo, en comparación con las pruebas tradicionales de susceptibilidad a los antibióticos, su eficacia sobre las bacterias adherentes a la superficie puede evaluarse en un entorno terapéuticamente más relevante. Además, la monitorización en tiempo real de la actividad antimicrobiana del tratamiento con láser a una longitud de onda de 405 nm a nivel unicelular proporcionaría una mejor comprensión de su modo de acción. A diferencia de los perfiles de haz originales gaussianos y no colimados de la fuente láser, el haz láser en las superficies de los microcanales se procesó en formas planas y colimadas (Fig. 2). Por lo tanto, la versatilidad de la configuración del sistema óptico redujo el tiempo y permitió una medición más precisa de la erradicación de biopelículas. Después de 90 minutos de irradiación con luz láser, las vitalidades de las biopelículas de S. aureus y C. albicans fueron del 19,8% y 26,4%, respectivamente, como lo demuestra la medición de la intensidad (Fig. 6c; p <0,01). Por el contrario, Peters et al. demostraron que la incubación de C. albicans en etanol al 30% (EtOH) durante 4 h era suficiente para matar y limitar el crecimiento, mientras que se requería EtOH al 50% para bloquear el nuevo crecimiento de S. aureus46. En otras palabras, las biopelículas de C. albicans eran más susceptibles al EtOH que las biopelículas de S. aureus. En el caso de la biopelícula mixta, se determinó que la viabilidad celular era del 31,5% después de 90 minutos de exposición a la luz láser (Fig. 7e), lo que indica que la biopelícula mixta era más resistente a la irradiación láser que las biopelículas monoespecies. Lara et al. También informaron que las infecciones por biopelículas mixtas de bacterias y hongos son más difíciles de tratar que las infecciones por biopelículas de una sola especie debido a la protección de la ECM por hongos, lo que sugiere una mayor tasa de mortalidad y costos de atención médica47. Según Zago et al., la coexistencia de S. aureus y C. albicans en el modo de desarrollo de la biopelícula tuvo un aparente impacto colectivo, con células bacterianas asociadas preferentemente con formas hifales de las células fúngicas48. Lin et al. propusieron un mecanismo plausible para la biopelícula mixta al asumir formas planctónicas de las dos bacterias que podrían interactuar mientras están en suspensión49. La coagregación puede ayudar a C. albicans a adquirir volumen, permitiéndole hundirse en el suelo del canal49. Esta afinidad de S. aureus por las hifas de C. albicans podría tener un papel crítico en la mayor virulencia de la infección mantenida por esta biopelícula mixta de hongos y bacterias50.

Este estudio tiene una limitación inherente debido al uso de sólo imágenes bidimensionales con un microscopio invertido, que podría superarse empleando microscopía de barrido láser confocal con imágenes del eje z51. Se necesitarán más estudios para obtener imágenes de alta resolución de la interacción polimicrobiana utilizando una cepa microbiana modificada con una construcción de proteína fluorescente. Además, dado que la plataforma propuesta permite el estudio de una amplia gama de microorganismos y condiciones de crecimiento, en el futuro se llevarán a cabo estudios sobre la formación de biopelículas de especies mono y dobles cultivadas en un medio sintético modificado que imita los fluidos y la secreción biológicos. . Finalmente, se continuarán investigando el mecanismo molecular de las interacciones entre especies duales en términos de medición química en tiempo real (p. ej., pH y O2), determinación de la distribución de componentes de EPS, medición de metabolitos secundarios microbianos, agotamiento de nutrientes y cambios morfológicos. mediante el uso de microsensores avanzados, microscopía, metabolómica y proteómica52,53,54,55,56,57. Además, se investigará la expresión genética asociada con la biopelícula y la virulencia para examinar el mecanismo molecular58,59. La cepa microbiana diseñada con la construcción de proteína fluorescente se utilizará para monitorear las imágenes de alta resolución de la interacción polimicrobiana.

Este estudio muestra una plataforma de microfluidos innovadora para monitorear tanto la formación como la erradicación de biopelículas de especies mono y duales de patógenos bacterianos (S. aureus) y fúngicos (C. albicans) en tiempo real. A diferencia de las condiciones estáticas, se investigó la interacción física entre S. aureus y C. albicans para formar una biopelícula de especies duales en diversas condiciones hidrodinámicas. El método propuesto puede visualizar la eficacia antimicrobiana de la luz láser de 405 nm en las biopelículas maduras establecidas de especies mono y duales de S. aureus y C. albicans. Otros estudios analizarán el efecto del entorno de microfluidos sobre las moléculas secretoras producidas por especies bacterianas o fúngicas durante el desarrollo de biopelículas. La plataforma desarrollada se utilizará para estudiar la terapia antimicrobiana in situ contra patógenos microbianos formadores de biopelículas asociados a la superficie.

La cepa bacteriana S. aureus (KCTC 1916) se obtuvo de la Colección Coreana de Cultivos Tipo (KCTC, Daejeon, Corea), mientras que la cepa fúngica C. albicans (KCCM 11282) se adquirió del Centro de Cultivo Coreano de Microorganismos (KCCM; Seodaemun-gu, Seúl, Corea del Sur). Los medios de crecimiento para el cultivo de S. aureus y C. albicans fueron caldo de soja tríptico (TSB; Difco Laboratory Inc., Detroit, MI, EE. UU.) y caldo de papa y dextrosa suplementado con un 5% de glucosa, respectivamente. Los cultivos microbianos se cultivaron en sus medios de crecimiento para biopelículas monoespecie, mientras que los medios de cultivo mixtos (50% TSB y 50% PDB) se emplearon para el crecimiento de biopelículas mixtas60. Estos microorganismos se almacenaron a -70 °C en glicerol al 20%. La temperatura para la preparación del cultivo de semillas y el subcultivo de microorganismos en una placa de agar fue de 37 °C.

La figura complementaria S1 muestra el diseño del dispositivo de microfluidos y la configuración experimental para el crecimiento de biopelículas. Se diseñaron tres canales independientes en una plataforma (distancia entre dos canales = 7 mm) para analizar simultáneamente las diferentes condiciones hidrodinámicas (es decir, tres caudales). Cada canal tiene dos entradas para microorganismos y suministro de medio y una salida para la recolección de desechos (consulte la figura complementaria S1a, b). Cada canal observado tenía un ancho de 100 µm y una altura de 180 µm (consulte la figura complementaria S1a). El chip de microfluidos de polidimetilsiloxano personalizado se diseñó utilizando el programa SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks Co., Francia). Se fabricó un molde fotorresistente (PR) para el micromezclador mediante fotolitografía de dos pasos utilizando un PR negativo (SU-2050, MicroChem Corp, EE. UU.). El PR para la primera capa de canal se recubrió por rotación sobre una oblea de silicio a 500 rpm durante 15 s y 1500 rpm durante 40 s. Se repitió el mismo recubrimiento por rotación para definir la segunda capa de cresta después del horneado de PR y la exposición a los rayos ultravioleta. Estas condiciones de giro dieron como resultado una altura del canal de 160 a 165 μm y una altura de cresta de 55 a 80 μm. El chip se construyó en un portaobjetos de vidrio de 76 mm × 26 mm (consulte la figura complementaria S1c). En la etapa de inyección inicial de microorganismos y medio, se construyó un mezclador en forma de espina de pescado en el chip de microfluidos para mezclar los microorganismos y el medio antes de que fueran inoculados en los canales observados61. Se utilizaron tubos Tygon (Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Francia) para conectar las entradas de microfluidos a las bombas de infusión (New Era Pump Systems, Inc., EE. UU.). Para evaluar la capacidad de mezcla del chip fabricado, se utilizaron y evaluaron pigmentos de dos colores (azul = sal disódica de erioglaucina; amarillo = tartrazina) midiendo el valor de gris.

La formación de biopelículas (S. aureus y C. albicans) en el canal de microfluidos se llevó a cabo según un procedimiento descrito con una ligera modificación36. S. aureus (cultivado en TSB) y C. albicans (cultivado en caldo de papa dextrosa con glucosa al 5%) cultivados durante la noche se diluyeron (1:100, equivalente a un valor de DO600 de 0,05) en sus respectivos medios de crecimiento. Para evitar la contaminación, la plataforma de microfluidos se lavó dos veces con alcohol etílico al 70% y se lavó nuevamente con un medio de crecimiento estéril. Para establecer una biopelícula monoespecie, el cultivo de microorganismos diluido preparado en sus respectivos medios de crecimiento se inyectó completamente en el canal de microfluidos y se dejó reposar durante 2 h para que se adhiriera a la superficie interna del canal (Fig. 8a). Por otro lado, para el establecimiento de una biopelícula de especies duales de S. aureus y C. albicans, se bombeó un volumen igual del cultivo celular del microorganismo diluido (preparado en sus respectivos medios de crecimiento) al canal de microfluidos utilizando bombas de infusión ( NE-1000, New Era Pump Systems, Inc., Nueva York, EE. UU.). Las salidas se bloquearon manualmente para eliminar completamente las burbujas de aire residuales de los canales debido a la alta presión acumulada. En las entradas de cada canal, se desplegaron dos trampas de aire para evitar la formación de burbujas de aire en los canales cuando se cambió el medio/cultivo fresco durante los experimentos. Las condiciones hidrodinámicas se controlaron utilizando bombas de infusión durante 24 h más de incubación (Fig. 8a). Según el informe anterior, los tres caudales se establecieron en 0,5, 1,0 y 1,5 µL/min (velocidad del flujo = 27,8, 55,6 y 83,4 mm/min, respectivamente)62,63. Se utilizó un microscopio invertido (CKX-53, Olympus, EE. UU.) para monitorear visualmente los procesos en tiempo real de adherencia microbiana, formación de biopelículas y tratamiento óptico. La formación de biopelículas se analizó y registró cada 2 h. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25 °C (temperatura ambiente). La Figura 8b muestra biopelículas bacterianas de S. aureus (izquierda), C. albicans (centro) y mixtas (derecha) formadas en los canales de microfluidos actuales.

Configuración experimental de la plataforma opto-microfluídica para cultivo y tratamiento de biopelículas: (a) configuración experimental y (b) biopelícula de S. aureus (izquierda), biopelícula de C. albicans (centro) y biopelícula de especies duales (S. aureus + C . albicans; derecha) (microscopio invertido IM, lentes L1-L2, difusor óptico OD, divisor de haz BS, computadora personal PC; barra de escala = 25 µm).

El número de Reynolds (Re) es un parámetro adimensional vital en flujos viscosos, particularmente en presencia de varias escalas de longitud. Para diseñar una plataforma de microfluidos bien caracterizada, generalmente se recomienda que el flujo tenga Re <100 para garantizar corrientes laminares en los canales. Re se puede expresar por 64

donde \(\rho\), D y μ son la densidad del medio (1000 kg/m3), el diámetro hidráulico del canal (100 μm), la velocidad del flujo del medio en los canales (27,8, 55,6, y 83,4 mm/min para caudales de 0,5, 1,0 y 1,5 µL/min, respectivamente), y la viscosidad dinámica del medio (0,89 mPa)65, respectivamente.

El esfuerzo cortante en el piso del microcanal se calculó mediante64

donde Q, w y h son el caudal volumétrico (μm3/s), el ancho del canal (180 μm) y la altura del canal (100 μm), respectivamente.

Se utilizó el software gratuito en línea 3DOPTIX (3DOptix Co., Tel Aviv, Israel) para realizar un modelo de trazado de rayos. Se utilizó una fuente de luz de 405 nm (CNI Co., Changchun, China) para analizar el efecto antimicrobiano de la luz láser en biopelículas maduras de especies mono y duales (Fig. 8). Se utilizaron dos lentes para colimar el rayo láser incidente (una lente asférica con una distancia focal efectiva de 25 mm y una lente convexa con un EFL de 6 mm; Edmund Optics Co., ciudad, estado, EE. UU.). Se utilizó un difusor óptico (Edmund Optics Co., ciudad, estado, EE. UU.) para remodelar el haz gaussiano colimado para aplicar emisiones espacialmente uniformes en canales de microfluidos. Este enfoque permitió que la plataforma de microfluidos se moviera libremente mientras se mantenía una intensidad constante de la luz láser en los canales. Para determinar la dosis efectiva de la luz láser de 405 nm en las biopelículas microbianas, se utilizaron tres divisores de haz (proporción = 50:50; Edmund Optics Co., EE. UU.) para administrar los canales de microfluidos. La luz láser aplicada a los canales observados se aplicó con dosis decrecientes, como 50%, 25% y 12,5%, durante 90 minutos con irradiancias láser de 0,2, 0,1 y 0,05 W/cm2 y fluencias láser de 1080, 540, y 270 J/cm2, respectivamente. Después de cada 10 minutos, se registró el efecto del tratamiento con láser contra biopelículas de especies mono y duales.

Los canales de microfluidos se observaron en tiempo real utilizando un microscopio invertido (CKX-53, Olympus, EE. UU.) con aumentos de 20 × y 40 × (campo brillante y contraste de fase) y una cámara digital (Nikon D3500 DSLR, Nikon Inc., EE.UU). Para determinar la cobertura de la biopelícula, el microscopio capturó las biopelículas visibles establecidas en el piso del canal de la plataforma de microfluidos (área del piso ~ 130 × 100 µm2) en tres sitios aleatorios (para cada medición, N = 3). Luego, todas las imágenes microscópicas adquiridas se convirtieron a formatos de 8 bits y se procesaron utilizando el software Fiji (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Luego, la cobertura de biopelícula se presentó como el porcentaje (%) del área de biopelícula medida con respecto al área capturada. El complemento TrackMate se utilizó para rastrear el movimiento unicelular de la formación temprana de biopelículas durante 12 h en un subconjunto del FOV66. Las imágenes de fluorescencia se realizaron con SYTO-9 y colorantes de yoduro de propidio para visualizar células vivas (teñidas de color verde) y muertas (teñidas de color rojo)67.

Para comparar la formación de biopelículas en el dispositivo de microfluidos con condiciones estáticas (sin agitación a 25 ° C), los cultivos celulares de S. aureus y C. albicans cultivados durante la noche se diluyeron en sus respectivos medios de crecimiento con una DO600 normalizada de 0,05. Para los ensayos de biopelículas monoespecie, el cultivo celular diluido en el medio de crecimiento se inoculó en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubó durante 24 h. De manera similar, para los ensayos de biopelículas de especies duales, se inocularon volúmenes iguales de cultivos diluidos (OD600 = 0,05) de S. aureus y C. albicans en la microplaca y se incubaron durante 24 h. Después de descartar las células que flotaban libremente, las células adheridas a la superficie se lavaron con agua y se tiñeron con violeta cristal al 0,1%. El cultivo celular teñido se disolvió en alcohol etílico al 95% y se cuantificó a 570 nm utilizando un lector de microplacas (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.).

Las arquitecturas de biopelículas de especies mono y duales establecidas en condiciones estáticas se visualizaron utilizando SEM (TESCAN; Vega II LSU, checo). Se cultivaron biopelículas de especies mono y duales en la superficie de una membrana de nailon (0,5 × 0,5 cm) y se colocaron en una microplaca de 24 pocillos. Después de 24 h de incubación a 25 °C, el cultivo celular se fijó directamente con formaldehído y glutaraldehído durante la noche a 4 °C. Las células fijadas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (pH = 7,4), seguido de deshidratación con concentraciones crecientes (50-100%) de alcohol etílico. Se usó un liofilizador (FD8518, ilShinBiobase Co. Ltd., Corea) para secar la membrana. La arquitectura de la biopelícula de la membrana de nailon se visualizó mediante un microscopio electrónico.

Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Cada grupo (tanto muestras de control tratadas como no tratadas) se midió cinco veces (N = 5). Debido al pequeño número de muestras de prueba y a los datos sin distribución, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para un análisis estadístico no paramétrico para evaluar las diferencias entre los grupos46. Se utilizó una corrección de Bonferroni con un valor p ajustado como prueba post hoc para minimizar las posibilidades de rechazar incorrectamente la hipótesis nula cuando se comparó cada par de grupos67,68. Se utilizó un programa SPSS (SPSS, Inc., Chicago, EE. UU.) para ayudar en el proceso de cálculo, y p < 0,5 se consideró estadísticamente significativo69.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2021R1A2C2003733) y el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Educación ( 2021R1A6A1A03039211).

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Van Nam Tran, Fazlurrahman Khan y Won Han.

Centro de tecnología biomédica integrada y de ingeniería biónica de convergencia de Industria 4.0, Universidad Nacional de Pukyong, Busan, 48513, Corea del Sur

Van Nam Tran, Maknuna Luluil, Van Gia Truong, Joong Ho Shin y Hyun Wook Kang

Centro de Investigación de Tecnología Biónica Marina Integrada, Universidad Nacional Pukyong, Busan, 48513, Corea del Sur

Fazlurrahman Khan, Young-Mog Kim y Hyun Wook Kang

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Nacional Pukyong, Busan, 48513, Corea del Sur

Won Han, Joong Ho Shin y Hyun Wook Kang

Departamento de Ingeniería Electrónica, Universidad de Hanyang, Seúl, 04763, Corea del Sur

Hyo Geun Yun y Sungyoung Choi

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Hanyang, Seúl, 04763, Corea del Sur

Sungyoung Choi

Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad Nacional Pukyong, Busan, 48513, Corea del Sur

Young-Mog Kim

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VNT, FK y WH concibieron, diseñaron y realizaron los experimentos, analizaron, crearon las figuras y escribieron el manuscrito. ML realizó el procesamiento de imágenes. VGT realizó los experimentos. YMK, JHS y HWK concibieron y supervisaron el estudio, revisaron el manuscrito y aprobaron la versión final. Todos los autores contribuyeron a la redacción crítica del manuscrito.

Correspondencia a Joong Ho Shin o Hyun Wook Kang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Tran, VN, Khan, F., Han, W. et al. Monitoreo en tiempo real de la formación y erradicación de biopelículas de especies mono y duales mediante una plataforma de microfluidos. Informe científico 12, 9678 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13699-9

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Recibido: 10 de diciembre de 2021

Aceptado: 26 de mayo de 2022

Publicado: 11 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13699-9

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